Mikroskop elektronowy-mikroskop wykorzystujący do obrazowania wiązke elektronów, który pozwala na dostrzeganie obiektów nawet miliony razy cieńszych niż ludzki włos(0,1nm). Mikroskop elektronowy pozwala badać strukturę materii na poziomie atomowym. Dzięki niemu możliwa jest obserwacja organelli komórkowych i wirusów. Próbka znajduje się w próżni i najczęście jest pokryta warstwą metalu. Wiązka elektronów przemiata badany obiekt i trafia do detektorów. Urządzenia elektroniczne odtwarzają na podstawie zmierzonych sygnałów obraz próbki. Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowal w 1931 roku Ernest Ruska wraz z Maksem Knollem w Berlinie.
Podstawy fizyczne - Podstawowym parametrem mikroskopu jest zdolność rozdzielcza, która określa rozmiary najmniejszych szczegółów jakie da się dostrzec w badanej próbce. Zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego ogranicza dyfrakcja(zjawosko fizycznej zmiany kierunku rozchodzenia się fali) promieni tworzących obraz. Im mniejsza jest długość fali tym mniejszy obiekt można obserwować. Granica rozdzielczości mikroskopu optycznego wynosi ok 200 nm(za wyjątkiem SNOM).
Typy miktoskopów elektronowych - Mikroskopy elektronowe możemy podzielić na zwykłe i skaningowe. W mikroskopach zwykłych jednocześnie analizowany jest duży obszar preparatu i tworzony jest jego obraz. W mikroskopie skaningowym w danym momencie analizowany jest niewielki obszar, który jest traktowany jak punkt. Tworzenie obrazu następuje przez zebranie informacji z kolejno analizowanych punktów.
Za pierwowzór i jednocześnie najprostszy mikroskop elektronowy uznano projektor elektronowy zwany też mikroskopem polowym.
Przygotowanie materiału biologicznego przed użyciem w mikroskopie elektronowym:
-pobranie materiału
-utwardzanie
-dehydratacja
-przesycenie zywicą
-zatopiwnie w żywicy
-krojenie ultra cienkich skrawkow
-kontrastowanie
Utwardzanie - przeprowadzane w ten sposób by zachowane zostały wszelkie właściwości ultrastrukturalne komórek i tkanek.
Musi być ono na tyle skuteczne by dalsze etapy obróbki wpływały minimalnie na organizacje tkankową i komórkową.
Obecnie stosowane metody:
-Z wykożystaniem bardzo niskich temperatur (-150`C - - 190`C). Proces zamrażania musi przebiegać niezwykle szybko (<20ms), co zapobiega tworzeniu kryształków lodu które mogłyby uszkodzić komórki.
-Utrwalanie chemiczne. Zasada działania utrwalaczy polega na tym, że tworzone są stabilne wiązania krzyżowe, głównie ale nie wyłącznie, pomiędzy pomiędzy grupami aminowymi białek obecnych w komórce czy tkance. Reakcja ta zachodzi niezwykle szybko, czego efektem jest trwała stabilizacja ultrastruktury.Nie istnie idealny utrwalacz.
W praktyce stosuje się:
-czterotlenek osmu
-aldehydy
-sole nadmanganianu
-diimidoestry
-mieszaniny wymienionych związków
Aldechydy - największe znaczenie mają mono lub di aldehydy takie jak:
-aldehyd glutarowy
formaldehyd
aldehyd akrylowy
Czterotlenek osmu - Stosowany po wstępnym utrwaleniu w aldehydzie glutarowym lub formaldehydzie. Reaguje szybko ze składnikami komórki, które nie zostały wcześniej związane przez aldehydy, głównie z nienasyconymi łancuchami kwasów.tł. obecnych w lipidach błonowych. Ze względu na to, że osm jest metalem ciężkim związany przez lipidy nadaje kontrast większości błon str. kom. Działa drastycznie na białka nie jest stosowany w metodach immunocytochemicznych.
Sole nadmanganianu - Są rzadziej stosowane, wpływają negatywnie na nielipidowe skł.komórki.
Dimidoestry - mniej popularna grupa utrwalaczy
Mieszanina utrwalaczy - stosowana w celu jednoczesnego utrwalenia wielu str. kom.
Czynniki wpływające na jakość utrwalania:
-Czas między pobraniem tkanki a umieszczeniu jej w środowisku utrwalacza - jak najkrótszy
-Wielkość fragmentu materiału - im mniejszy - tym lepsze utrwalanie
-Temperatura
-Typ tkanki
-Czas utrwalania
-Stosowany rozpuszczalnik
Sposoby utrwalania chemicznego: - Utrwalanie perfuzyjne - stosowanie do utrwalania tkanek a nawet całych organów zwierząt wyższych i opiera się na wykorzystaniu elementów układu krwionośnego do rozprowadzenia utrwalacza. Zastępuje się krew utrwalaczem.
Utrwalanie przez zanurzenie - umieszczenie fragmentu tkanki w roztworze utrwalającym.
Utrwalanie przez nakrapianie - nakraplanie roztworu utrwalającego przez nakroplenie bezpośrednio na tkankę.
Utrwalenie przez iniekcję - utrwalacz wstrzikiwany jest do wnętrza organu.
Odwadnianie - Utrwalany materiał zanim zostanie zatopiony w odpowiednim medium poddawany jest obróbce chemicznej obejmującej odwodnienie i stopniowe przesycenie roztworami o wzzrastającym stężeniu sub. w której ostatecznie zostanie zatopiona tkanka. Substancje stosowane do zatapiania to żywice. Etap odwadniania konieczny jest gdy żywica jest nierozpuszczalna w H2O. Większość żywic jest rozpuszczalna w rozpuszczalnikach organicznych takich jak etanol czy aceton. Proces odwadniania obejmuje traktowanie materiału biologicznego wodnymi roztworami czynnika odwadniającego o wzrastającym stężeniu.
Zatapianie - Ostatni etap obróbki polega na przesyceniu odwodnionej tkanki 100% roztworem sub.. która w wyniku określonych procesów chemicznych zmieni stan skupienia z ciekłego w stały co umozliwia:
-konserwację i unieruchomienie tkanki w zwartej bryle plastiku o określonych wymiarach
-pokrojenie tkanki na ultracienkie skrawki
Obecnie medium do zatapiania to żywice syntetyczne.Proces polega na umieszczeniu odwodnionej tkanki w mieszaninie żywicy i jej rozpuszczalnika (100% etanolu/acetonu). Ostatecznie zatopiony materiał umieszczany jest w róznego rodzaju kapsułkach żelatynowych lub polietylenowych i zatapiany w żyeicy która poddana jest polimeryzacji.
Wyrózniamy 2 rodzaje żywic:
-akrylowe
-epoksydowe
Ultramikrotomia
Skanowanie - Materiał umieszczany w żywicach musi być pocięty na skrawki ok 20-60mm. Wstępnym etapem jest przygotowanie bloczków tak aby powierzchnia cięcia była jak najmniejsza.
Mikrotomy - użądzenia do tworzenia ultracienkich skrawków (uzywa się nozy szklanych i diamentowych).
Siatki podtrzymujące i zbierające skrawki - Obserwacja skrawków jest możliwa w mikroskopie e. dopiero po umieszczeniu ich na specjalnych siateczkach.
Siateczki: miedziane, stalowe/złote/niklowe/platynowe (do analizy cytochemicznej).
Kontrastowanie - Rodzaje:
-pozytywne
-negatywne
W poz. zw. wiążą się ze strukturami biologicznymi. W neg. środowisko jest kontrastowane - ciemne.
Zw.:
-sole met. cięzkich
-kw. fosforowolframowy
-nadmanganian potasu
Znaczenie ma: Grubosć skrawka, pH roztworu kontr., czas kontrastowania, preparacja zw. kontrastującego.